L’editing genetico è passato dall’essere una curiosità di laboratorio a una realtà clinica. Le terapie basate sulla tecnologia CRISPR stanno raggiungendo i pazienti e la scienza alla loro base si è notevolmente evoluta negli ultimi due decenni. Tuttavia, un problema persiste fin dall’inizio: questi sistemi a volte modificano la parte sbagliata del genoma. Un team di ricerca composto da diverse istituzioni in Cina ha ora utilizzato AlphaFold di Google, uno strumento IA per il ripiegamento delle proteine, per identificare esattamente quali parti di una proteina per l’editing genetico siano responsabili di questi errori, riprogettandole poi per ridurre in modo sostanziale gli sbagli.
Il problema degli off-target che rende rischioso l’editing genetico su larga scala
Per capire perché questo sia importante, aiuta comprendere l’architettura di base di un sistema di editing genetico basato su CRISPR. Vi sono tre componenti fondamentali. Il primo è un RNA guida, una breve sequenza molecolare progettata per corrispondere a uno specifico tratto di DNA nel genoma. Il secondo è una proteina Cas, la più famosa delle quali è la Cas9, che si lega fisicamente sia all’RNA guida sia al DNA bersaglio e garantisce la specificità dell’interazione. Il terzo è una proteina effettrice che modifica effettivamente il DNA una volta che il complesso si trova nella posizione corretta.
L’RNA guida è solitamente lungo circa 18 basi. Statisticamente, una sequenza di quella lunghezza dovrebbe comparire solo una volta in circa 70 miliardi di basi di DNA casuale, e il genoma umano è composto da soli 3 miliardi di basi circa. Sulla carta, il sistema dovrebbe essere sufficientemente preciso da evitare modifiche accidentali. La complicazione risiede nel fatto che la Cas9 può tollerare un piccolo numero di basi non corrispondenti e legarsi comunque a una sequenza di DNA. Ciò significa che occasionalmente si aggancia a siti simili ma non identici al bersaglio previsto, producendo ciò che i ricercatori chiamano effetti off-target.
In ambito terapeutico, questo non è un problema puramente teorico. I trattamenti richiedono la modifica di un numero elevato di cellule e anche un errore a bassa probabilità, ripetuto su milioni di eventi di editing, diventa statisticamente inevitabile. Ridurre tale tasso di errore non è un’opzione, ma un prerequisito per un uso clinico sicuro.
Come AlphaFold ha svelato le radici strutturali del problema
L’intuizione del team di ricerca è stata di natura strutturale. Un ibrido DNA-RNA perfettamente abbinato ha una forma tridimensionale specifica. Un ibrido con una o più basi non corrispondenti presenta una forma leggermente diversa. La Cas9 si è evoluta per riconoscere la forma corretta, ma l’evoluzione non le ha impedito di assumere conformazioni leggermente diverse che le consentono di interagire anche con le versioni non perfettamente corrispondenti.
Per individuare quali parti della Cas9 fossero responsabili di questa flessibilità, il team ha innanzitutto creato un’ampia libreria di siti di editing off-target noti. Hanno utilizzato un sistema CRISPR modificato per convertire una specifica base del DNA, l’adenina, in un composto chimico affine chiamato inosina, isolando e analizzando poi i frammenti di DNA risultanti. Hanno ripetuto questo processo con 10 diversi RNA guida per ottenere un quadro generale del panorama degli off-target.
Hanno quindi inserito questi dati in AlphaFold. Inizialmente il complesso completo si è rivelato troppo complicato da gestire correttamente per il software, che ha posizionato una proteina nel luogo errato. Il team ha così semplificato l’input includendo solo il DNA, l’RNA guida e la Cas9 stessa, e i risultati si sono allineati bene con le strutture determinate tramite esperimenti fisici.
Confrontando i risultati di AlphaFold per i siti on-target e off-target, sono emersi schemi chiari. Circa due terzi dei siti off-target portavano la Cas9 ad assumere una struttura complessiva leggermente diversa. Aspetto ancora più sorprendente, oltre il 95% di essi alterava i punti in cui gli amminoacidi della Cas9 entravano in contatto con l’RNA. Il team ha sviluppato un framework di analisi chiamato ContactSeek, che ha sfruttato la capacità integrata di AlphaFold di calcolare la “probabilità di contatto” — essenzialmente la probabilità che due componenti molecolari si trovino entro otto Ångström l’uno dall’altro — per mappare esattamente quali amminoacidi modificassero il proprio comportamento nei siti off-target.
ContactSeek ha generato un lungo elenco di amminoacidi candidati. Il team si è concentrato sulle regioni in cui questi candidati si raggruppavano, interpretando il raggruppamento come un segno che tali aree si stavano adattando attivamente per accogliere basi non corrispondenti. Hanno quindi testato 23 diverse sostituzioni amminoacidiche in 10 posizioni chiave. Il risultato è stato una variante della Cas9 che manteneva la normale attività di editing sui siti bersaglio previsti, mentre la sua attività off-target crollava dal 28% al 5%. L’approccio ha funzionato anche con diversi RNA guida e con un sistema affine che utilizza una proteina differente, la Cas12.
Perché un metodo conta più di un singolo risultato
Altri gruppi di ricerca hanno sviluppato varianti migliorate della Cas9 attraverso tecniche differenti, tra cui l’evoluzione diretta. Le nuove varianti hanno mostrato prestazioni paragonabili o leggermente superiori rispetto a queste alternative esistenti. Tuttavia, il contributo più significativo di questo studio non risiede in una singola proteina migliorata, ma nel metodo stesso.
I precedenti approcci per ridurre gli effetti off-target tendevano a produrre varianti di Cas9 con miglioramenti di carattere generale, ossia proteine generalmente più precise in un ampio spettro di situazioni. L’approccio ContactSeek, al contrario, individua modifiche che possono essere più specifiche per una particolare combinazione di RNA guida e mismatch. Ciò apre alla possibilità di progettare sistemi di editing genetico personalizzati non solo per un gene bersaglio, ma per il contesto genomico specifico di un singolo paziente, mappando e minimizzando in anticipo i rischi di off-target.
I ricercatori notano inoltre che le modifiche amminoacidiche individuate tramite questo metodo potrebbero potenzialmente essere combinate con quelle già presenti in varianti di Cas9 sviluppate in precedenza, sebbene tale combinazione non sia stata testata in questo studio.
È questo l’aspetto che sfugge alla maggior parte delle trattazioni sull’IA in biologia. AlphaFold non è semplicemente uno strumento per predire la forma delle proteine, ma sta diventando uno strumento analitico per comprendere come le proteine si comportano in condizioni diverse e per identificare le specifiche leve molecolari che ne controllano il comportamento. Questo passaggio — dalla descrizione alla diagnosi fino alla progettazione — è ciò in cui risiede il vero valore scientifico.
In sintesi
Un team di ricerca ha utilizzato AlphaFold per mappare quali parti della proteina Cas9 facilitano gli errori di editing genetico, riprogettandole poi per ridurre l’attività di editing off-target dal 28% al 5%. Il metodo, battezzato ContactSeek, funziona con diversi RNA guida e diverse proteine Cas. La sua rilevanza più ampia non sta solo nell’aver ottenuto una proteina più sicura, ma nell’aver fornito un framework generale per ingegnerizzare sistemi di editing genetico con profili d’errore noti e controllabili — una capacità che potrebbe rivelarsi fondamentale man mano che queste terapie avanzano nell’impiego clinico.
Basato su un articolo di Ars Technica.